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小鼠胚胎干細(xì)胞體外EB分化鑒定

更新時間:2014-02-07 點(diǎn)擊次數(shù):1746

實(shí)驗(yàn)概要
本方法主要介紹小鼠胚胎干細(xì)胞體外EB分化鑒定流程。
主要試劑
高糖DMEM(Gibco,cat 2800-017粉末)、DMEM/F12(Gibco,cat 2500-062粉末)、胎牛血清(FBS)(Gibco,cat 6000044)
非必需氨基酸(NEAA) (Gibco,cat 1140050)、胰酶0.25% (1X) with EDTA 4Na, liquid(Gibco,cat NO:25200072)、明膠(BD,cat NO:354277)、青鏈霉素(SP)(Gibco,cat 5140122)、L-谷氨酰胺(Gibco,cat NO:25030081)、血清替代物(Gibco,cat 0829028)
10%FBS培養(yǎng)液(Gibco , cat 0099141)
主要設(shè)備
1、超凈臺
2、CO2培養(yǎng)箱(Thermo , cat NO.3131)
3、6cm培養(yǎng)皿(corning , cat NO.430166)、10cm培養(yǎng)皿(corning , cat NO.430167)
4、15ml離心管(corning , cat NO.430791)、50ml離心管(corning , cat NO.430829)、凍存管(corning , cat NO.430659)
5、正置顯微鏡
實(shí)驗(yàn)步驟
①常規(guī)方法消化細(xì)胞,吹打時用粗口滴管,只吹打成細(xì)胞團(tuán)塊;
②將細(xì)胞團(tuán)塊移至6 cm或10 cm培養(yǎng)皿中,改用含10%FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)(每個6 cm培養(yǎng)皿加5 ml培養(yǎng)液);
③將培養(yǎng)皿放入37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每天取出1-2次,輕輕晃動或用粗口滴管吹打,使細(xì)胞懸浮,各團(tuán)分開,并逐日觀察;
④一般培養(yǎng)第3天細(xì)胞團(tuán)開始分層,外部是一層較大的內(nèi)胚層樣細(xì)胞,內(nèi)部的細(xì)胞則小而緊密,為外胚層樣細(xì)胞和干細(xì)胞,此為簡單類胚;再培養(yǎng)5-10天,分層增多,并出現(xiàn)空腔,整個胚呈圓泡狀,此為囊狀胚。
⑤收集囊狀胚,提取mRNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后使用三胚層的引物進(jìn)行PCR來檢測三胚層的基因的表達(dá)情況,從而確定囊狀胚中是否有三胚層的分化,這樣可以確定細(xì)胞是否具有在體外分化為三胚層細(xì)胞的能力。

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